Cum se efectuează o pată Gram

Gramul gram este o procedură rapidă utilizată pentru a verifica prezența bacteriilor în probele de țesut și a le identifica ca gram-pozitivi sau gram-negativi, pe baza proprietăților chimice și fizice ale pereților lor celulari. Pata Gram ar trebui să fie întotdeauna primul pas în diagnosticarea unei infecții bacteriene.

Această practică este numită după om de știință danez Hans Christian Gram (1853-1938), care a dezvoltat-o ​​în 1882 și a publicat-o în 1884, ca o tehnică pentru a distinge două tipuri de bacterii cu simptome clinice similare: Streptococcus pneumoniae (cunoscut și ca pneumococ) și Klebsiella pneumoniae

paşi

Partea 1

2

Sterilizați diapozitivul. Dacă este murdar, spălați-l cu săpun și apă pentru a elimina grăsimea și murdăria. Apoi dezinfectați-l cu etanol, cu un detergent de sticlă sau cu orice altă metodă recomandată de procedurile de laborator în care lucrați.

3

Puneți o mostră simplă pe diapozitiv. Puteți utiliza tehnica de colorare Gram pentru a identifica bacteriile prezente pe un eșantion medical sau cultura unui vas Petri. Pentru ca un colorant Gram să fie util, trebuie să adăugați o subțire strat de probă pe colorant. Este mai bine să lucrați la un eșantion de cel puțin 24 de ore, deoarece după această perioadă există o șansă mai mare ca membranele celulare ale bacteriilor să fie deteriorate și, prin urmare, colorarea este mai puțin eficientă și precisă.

4

Se încălzește eșantionul pentru a fixa frotiul. Căldura permite ca proba să adere la diapozitiv, astfel încât să nu se piardă în timpul procesului de clătire. Glisați rapid glisorul de două sau trei ori pe flacăra unui arzător Bunsen sau utilizați un încălzitor electric special. Totuși, încercați să nu supraîncălziți frotiul pentru a preveni distorsionarea acestuia. Dacă utilizați ciocul lui Bunsen, ajustați flacăra astfel încât să fie un conul albastru, nu lung și portocaliu.

5

Așezați diapozitivul pe tava de colorare. Este un mic vas mic din plastic, sticlă sau metal cu grătar sau plasă de sârmă deasupra. Așezați diapozitivul peste această plasă astfel încât lichidele utilizate să poată rula în placa de dedesubt.

Partea 2

2

Clătiți ușor violet cristal. Înclinați diapozitivul și utilizați o sticlă de pulverizare pentru ao spăla cu un curent de apă distilată sau atingeți. Apa trebuie să curgă pe frotiu fără ca fluxul să-l lovească direct. Nu exagerați această operație deoarece ați putea elimina petele de celulele bacteriene gram-pozitive.

3

Clătiți proba cu iod și apoi cu apă. De asemenea, în acest caz, utilizați o pipetă și acoperiți frotiul cu iod. Așteptați 60 de secunde și apoi clătiți cu aceeași metodă descrisă mai sus. Iodul, sub formă de ioni negativi, interacționează cu cationii CV + pentru a forma mai mari complexe cristaline și iod (CV-I) între straturile interioare și cele exterioare ale celulelor. Această fază permite fixarea culorii purpuri pe celulele în care a fost absorbită.

4

În acest moment eșantionul este decolorat și se procedează la o clătire rapidă. Pentru această fază, se utilizează de obicei un amestec de părți egale de acetonă și etanol. Timpul de albire trebuie monitorizat foarte atent. Luați diapozitivul și înclinați-l, adăugați amestecul de albire până când nu mai observați culoarea purpurie în fluxul de clătire. În general, este nevoie de 10 secunde de curgere cu substanța de înălbire (sau chiar mai puțin dacă concentrația de acetonă din amestec este ridicată). De îndată ce tot violetul de gențiană a fost îndepărtat din celulele gram-pozitive și negative, opriți sau va trebui să repetați din nou. Clătiți imediat amestecul de albire în exces utilizând metoda descrisă mai sus.

5

Ștergeți frotiul cu culoarea de fundal și apoi clătiți-l. Culoarea de fundal, mai ales safranina sau fuchsina, este folosită pentru a crește contrastul dintre bacteriile gram-pozitive și gram-negative prin colorarea acestora din urmă (care au fost albite cu acetonă) de roz sau roșu. Lăsați cel de-al doilea vopsea pe loc timp de cel puțin 45 de secunde și apoi clătiți-l.

6

Se usuca diapozitivul. Aveți posibilitatea să așteptați să se usuce în aer sau să folosiți hârtie absorbantă special concepută pentru acest scop. Pata Gram este acum completă.

Partea 3

2

Recunoașteți bacteriile gram-pozitive și gram-negative. Acesta examinează diapozitivul cu microscopul de lumină - bacteriile pozitive vor fi violete datorită violetei cristaline prinse în membranele lor de celule groase. Gram-negativul va fi roz sau roșu, deoarece violet de gențiană a fost "spălat" de pereții celulelor subțiri, iar vopseaua de fundal a pătruns.

3

Verificați imaginile de referință. Dacă nu sunteți sigur care sunt bacteriile, puteți verifica o colecție de imagini, catalogată prin forma și colorarea Gram. Puteți găsi numeroase baze de date online. Pentru a facilita identificarea, cele mai frecvente sau cele mai relevante din punct de vedere medical sunt bacteriile clasificate prin pata și forma Gram.

4

Recunoașteți bacteriile gram-pozitive pe baza formularului. Bacteriile, precum și colorantul, sunt de asemenea grupate în funcție de forma care apare sub microscop. Cele mai frecvente sunt "cocci" (sferice) sau tije (cilindrice). Iată câteva exemple de bacterii gram-pozitive (purpuriu colorat) clasificate după forma:

5

Identifică bacteriile gram-negative. Acestea sunt colorate roz și sunt clasificate, în cea mai mare parte, în trei grupe. Nuci de cocos cu formă sferică, tije lungi și subțiri și, în final, coccoidele care sunt o cale de mijloc.

6

Evaluați rezultatele mixte. Unele bacterii sunt greu de evaluat cu exactitate datorită pereților lor celulați fragili sau impermeabili. Ele pot prezenta o culoare mixtă purpurie și roz sau culori diferite pentru bacteriile de același tip prezente în același frotiu. Toate probele mai vechi de 24 de ore prezintă această problemă, dar există tulpini de bacterii care sunt dificil de detectat în fiecare etapă. În acest caz, sunt necesare teste specifice pentru a reduce gama de posibilități și pentru a le identifica, cum ar fi colorarea Ziehl-Neelsen, observarea culturii, testarea genetică și agarul STI.

7

Aruncați materialul. Proceduri pentru eliminarea schimbării materialelor de la laborator la laborator pe baza aceluiași tip de material. De obicei, lichidele din tava de colorare sunt eliminate ca deșeuri periculoase după ce au fost sigilate în sticle speciale. Diapozitivele sunt sterilizate într-o soluție de albire de 10% și apoi îndepărtate ca instrumente ascuțite.